腸道腫瘤類器官的研究與應(yīng)用

類器官是一項創(chuàng)新性較高的研究技術(shù)，近幾年來受到科研人士的追捧和廣泛好評。目前，我們國家在政策層面也給予了大力地支持。2021年科技部發(fā)布的“十四五”國家重點研發(fā)計劃“干細胞研究與器官修復(fù)”重點專項中也特別提到疾病類器官模型。

什么是類器官（Organoids）？

類器官屬于三維（3D）細胞培養(yǎng)物，包含其代表器官的一些關(guān)鍵特性。類體外培養(yǎng)系統(tǒng)包括一個自我更新干細胞群，可分化為多個器官特異性的細胞類型，與對應(yīng)的器官擁有類似的空間組織并能夠重現(xiàn)對應(yīng)器官的部分功能，從而提供一個高度生理相關(guān)系統(tǒng)。成體干細胞的組織樣本、單一成體干細胞或者通過多能干細胞的定向誘導(dǎo)分化都能夠產(chǎn)生類器官。而細胞系異質(zhì)性差，遺傳信息丟失，無法模擬組織器官體內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)‍；動物模‍型具有建模周期長，成本高等問題。

類器官的應(yīng)用前景

‍‍‍‍‍2013年，類器官技術(shù)被Science譽‍為10 大科技進展，2017年，又被Nature Methods評為生命科學(xué)領(lǐng)域的年度技術(shù)。類器官技術(shù)具有*的創(chuàng)新性，近年來一直是研究熱點，到目前為止已取得多項重大研究領(lǐng)域的突破‍，但其應(yīng)用研究目前依然處于起步階段，其作為一種工具，在廣泛的應(yīng)用研究方面潛力巨大，包括發(fā)育生‍物學(xué)、疾病病理學(xué)、細胞生物學(xué)、再生機制、精準醫(yī)療以及藥物毒性和藥效試驗。對于這些應(yīng)用以及其他應(yīng)用，類器官培養(yǎng)‍實現(xiàn)了對現(xiàn)有2D培養(yǎng)方法和動物模型系統(tǒng)的高信息量的互補。此外，通過類器官繁殖的干細胞群取代受損或者患病的組織，類器官提供自體和同種異體細胞療法的可行性，未來這一技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也擁有巨大的潛力。‍‍‍‍‍‍

2022 年 1 月 19 日，由諾丁漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院癌癥遺傳學(xué)和干細胞組Abdolrahman S. Nateri教授團隊在ONCOGENESIS(影響因子7.485)發(fā)表了新研究成果，題為《Anti-miR-135/SPOCK1 axis antagonizes the inflfluence ofmetabolism on drug response in intestinal/ colon tumourorganoids》。

圖：研究概要和亮點

本研究旨在通過雙突變Apc Min Fbxw7 ΔG小鼠結(jié)直腸癌 (CRC) 模型的十二指腸息肉和非息肉衍生類器官 (mPO 和 mNPO) 來研究失調(diào)miRNA與代謝成分之間的關(guān)系。文中分析了mPO 和 mNPO中表達失調(diào)的miRNA和代謝相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)miR-135可能靶向Spock1基因。SPOCK1的上調(diào)表達水平與CRC的疾病進展密切相關(guān)。敲低CRC患者來源的腫瘤類器官(CRC tPDO)中miR-135b的表達水平，可以降低SPOCK1 表達水平、葡萄糖消耗和乳酸分泌。然而，由miR-135b過表達誘導(dǎo)的SPOCK1增加，則促進Warburg效應(yīng)，從而促進5FU的抗腫瘤作用。因此，與miR-135b反義核苷酸的組合療法可能代表了一種新的CRC治療策略。

研究背景

腸道類器官是一種實驗?zāi)Ｐ停Y(jié)合了在體外產(chǎn)生整個隱窩上皮細胞多樣性，以及生成的生物量相對較快和易于處理的優(yōu)勢。因此，腸道類器官是探索內(nèi)在上皮細胞缺陷復(fù)雜性的良好的實驗平臺。至今，只有少數(shù)的研究涉及到腸道類器官培養(yǎng)物中代謝物的鑒定。

研究結(jié)果

1. 與mNPO相比，mPO中葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量增加

腺癌是常見的小腸癌類型，大多數(shù)這些腫瘤發(fā)生在十二指腸，這是小腸最靠近胃的部分。為了分析小息肉和非息肉部位中的葡萄糖和乳酸代謝譜，研究者構(gòu)建小鼠十二指腸息肉衍生類器官(mPO)與非息肉衍生類器官(mNPO)模型，通過對其培養(yǎng)基分析發(fā)現(xiàn)，與mNPO相比，mPO的葡萄糖消耗率和乳酸生成更高，這表明代謝向無氧糖酵解的轉(zhuǎn)變以維持更高的mPO生長和新的腫瘤細胞的產(chǎn)生。

為了驗證上述代謝測定中的結(jié)論，研究者采用qPCR分析了12個代謝相關(guān)基因的mRNA表達水平，所選基因均參與細胞代謝過程(葡萄糖、活性氧、脂肪酸攝取和組織重塑)。結(jié)果表明Aldob、Cyba、HexII、Fabp6、Slc2a5和Spock 1(又名Testican-1，是一種細胞外基質(zhì)蛋白)、Spock2的表達水平上調(diào)，而G6pc、Slc2a1和Slc2a2下調(diào)，但是Ephx2和Gstt1在mPO與mNPO中沒有變化。蛋白質(zhì)印跡分析也證實了SPOCK1和SPOCK2蛋白在mPO中被誘導(dǎo)，這與 mRNA水平的表達相一致。其中，SPOCK1 是 TGF-β的正向下游調(diào)節(jié)因子，其表達通過 Wnt/β-catenin 途徑進行調(diào)節(jié)。除了生理功能外，SPOCK1還是CRC的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

2. 分析mPO與mNPO中癌癥相關(guān)miRNA的表達差異

為了鑒定息肉腫瘤發(fā)展過程的miRNA，采用miRCURY LNA miRNA測定十二指腸 mNPO和mPO之間的miRNA表達譜，使用Exiqon-GenEx-qPCR分析軟件對miRNA表達(2^–ΔΔCT) 進行標準化和統(tǒng)計分析。最終，鑒定了幾個與癌癥相關(guān)miRNA，與mNPO相比，在mPO中的表達存在顯著差異。其中包括 let-7 家族成員在內(nèi)的幾種 miRNA顯著下調(diào)，以及13個miRNA在mPO中顯著上調(diào)表達(>3倍)。

3. miR-135靶向代謝介質(zhì)細胞外基質(zhì)糖蛋白SPOCK1

通過TargetScan Web預(yù)測發(fā)現(xiàn)Spock 1是miR-135的潛在靶標。而且，SPOCK1的表達增加與人結(jié)腸腺癌(COAD)的總生存期(OS)差有關(guān)。階段圖分析表明，在COAD癌癥階段，SPOCK1的表達逐漸升高，在晚期階段(StageIII 和StageIV)的表達相對最高。

對預(yù)測的miR-135-5p的系統(tǒng)搜索分析顯示，超過670個預(yù)測基因與細胞代謝(葡萄糖、活性氧、代謝、代謝、脂肪酸攝取和組織微環(huán)境)相關(guān)。先前的研究也表明，抑制CRC小鼠模型中的miR-135b，可通過控制增殖、侵襲和凋亡相關(guān)基因，進而降低腫瘤生長，其可作為檢測CRC和晚期腺瘤的無創(chuàng)生物標志物。臨床患者衍生的類器官 (PDOs)這代表了一個臨床相關(guān)的研究平臺。接下來，研究團隊培養(yǎng)了患者來源的腫瘤類器官(tPDO)和鄰近的癌旁來源的類器官(hPDO) 。qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)CRC tPDO 中SPOCK1和miR-135b的表達水平顯著高于CRC hPDO。

為了研究miR-135b對SPOCK1表達水平的調(diào)節(jié)作用，用對照載體慢病毒(Control)或 miRZip-135b(anti-miR-135b)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)tPDO，而后驗證了抗miR-135b顯著降低了CRC tPDO中miR-135b的表達水平。為了確認miR-135b/ SPOCK1軸能夠影響tPDO中的代謝反應(yīng)，對重要的腫瘤代謝物濃度(抗miR-135b處理的類器官培養(yǎng)基中的乳酸和葡萄糖)進行了測定，發(fā)現(xiàn)抗miR-135b可減少葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生。此外，為了確認miR-135b/ SPOCK1轉(zhuǎn)錄調(diào)控軸，又開展了雙熒光素酶報告分析，發(fā)現(xiàn)與抗miR-135b共轉(zhuǎn)染顯著抑制了含有野生型SPOCK1 3'-UTR-reporter的細胞中熒光素酶活性，而非突變型SPOCK1 3'-UTR-reporter。此外，抑制CRC tPDO中的miR-135b表達后，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SPOCK1 mRNA水平顯著降低，而SPOCK2沒有變化。總之，以上結(jié)果證明了SPOCK1是miR-135b的靶標基因，用抗miR-135b治療能夠降低SPOCK1的表達。

4. 抑制miRNA-135/ SPOCK1軸使tPDOs細胞對5-FU誘導(dǎo)的細胞抑制作用和細胞毒性敏感

研究團隊在tPDO中敲低miR-135b后進行了5-FU(5-Fluorouracil)的細胞抑制和形態(tài)學(xué)測定，發(fā)現(xiàn)與miRZip-135b的聯(lián)合治療可使tPDOs細胞對5-FU誘導(dǎo)的細胞抑制作用敏感，并加劇了對SPOCK1 基因表達的抑制作用。

此外，通過 SRB 比色法評估了同步/血清饑餓的人APC突變的結(jié)腸直腸癌細胞系DLD-1 與正常結(jié)腸細胞CCD-841在用10次增加劑量的5-FU±anti-miR-135治療后的存活率。結(jié)果表明，與CCD-841-anti-miR-135細胞(IC50=17.48±1.083)相比，5-FU在DLD-1-anti-miR-135(IC50=10.86±1.135)中表現(xiàn)出更大的細胞毒性。miR-135b敲低(+anti-miR-135) 對結(jié)腸癌DLD-1細胞的敏感性高于非癌性(CCD-841) 細胞[DLD-1+anti-miR-135(IC50=5.383±1.188) vs. CCD-841+抗miR-135細胞(IC50= 14.07±1.103)]。選擇性指數(shù)(SI)的計算方法是將抗miR-135細胞的IC50除以 miR-135b敲低細胞的IC50(DLD-1 SI=2.017 vs. CCD-841 SI=1.242)。SI是一個給出選擇性概念的指標，最高值表示更具選擇性的候選者。我們的數(shù)據(jù)與miR-135抑制可影響CRC細胞系對化療藥物耐藥性的觀察結(jié)果一致。

本文小結(jié)

本研究創(chuàng)新性地采用腸道類器官模型，研究腫瘤和鄰近的非腫瘤類器官(tPOh和tNPO)中具有不同的代謝活性，以及與代謝相關(guān)的miRNA表達譜，并確立了miR-135通過靶向SPOCK1從而影響細胞代謝的關(guān)鍵作用，證明了miR-135和SPOCK1協(xié)同影響腫瘤細胞的代謝和藥物反應(yīng)。這為CRC的治療提供了新的思路和理論依據(jù)，也為類器官模型在腫瘤藥物篩選的研究和應(yīng)用方面打下了一定程度的基礎(chǔ)。

文獻來源：Babaei-Jadidi, R., Kashfi, H., Alelwani, W. et al. Anti-miR-135/SPOCK1 axis antagonizes the influence of metabolism on drug response in intestinal/colon tumour organoids. Oncogenesis 11, 4 (2022). 

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