基于葡聚糖硫酸鹽納米光敏劑靶向腫瘤相關巨噬細胞的光動力抗癌療法

腫瘤中存在的腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的M2樣表型促進腫瘤生長和轉移。因此，靶向M2樣TAM是一種潛在的癌癥治療策略。然而，針對M2巨噬細胞的全身治療可能會抑制腫瘤組織中的TAM以及在正常過程中起關鍵作用的其他M2巨噬細胞，導致免疫功能低下狀態的風險增加。光動力療法（PDT）是一種非侵入性的局部癌癥治療方法，通過聯合使用光敏劑和無害光產生活性氧（ROS），誘導膜損傷和細胞凋亡。重要的是，PDT的治療效果僅限于光治療的腫瘤區域。因此，在不影響正常巨噬細胞的情況下，局部PDT是一種很好的癌癥治療選擇。本文作者Kyeongsoon Park將二者進行結合，在International Journal of Biological Macromolecules（IF=8.5，一區）上發表題名為Tumor-associated macrophage-targeted photodynamic cancer therapy using a dextran sulfate-based nano-photosensitizer的研究成果，制備了一種基于葡聚糖硫酸鹽的納米光敏劑（葡聚糖硫酸鹽二氫卟吩e6, DS-Ce6），專門針對M2樣TAM進行增強光動力治療（PDT），從而用于抑制腫瘤的生長和轉移。

DS-Ce6是由DS（SR-A的特異性配體）與Ce6（光敏劑）化學偶聯合成的，作者通過UV/Vis和FT-IR分析證實了DS-Ce6的合成，并使用粒徑分析測量了DS-Ce6的粒徑大小和分布，最后進行了單線態氧1O2的生成測試，在670 nm連續波激光照射下，使用單線態氧傳感器檢測DS-Ce6產生的單線態氧的量，以評估光動力療法的效果。通過這些合成和表征步驟，作者能夠確保DS-Ce6具有預期的化學結構、粒徑和光敏性，使其能夠有效地被M2型TAMs攝取并在光照下產生細胞毒性的活性氧（ROS），從而實現對腫瘤細胞的有效殺傷。隨后作者驗證了M2巨噬細胞SR-A的表達情況，在巨噬細胞的極化狀態中，M2巨噬細胞通常由IL-4和IL-13誘導，通過表達MRs （CD206）和SRs （SR-A, CD204）來識別。Western blot分析結果表明，IL -4衍生的M2巨噬細胞劑量依賴性地增加SR-A的表達。

作者在本實驗研究了DS-Ce6對IL -4處理的巨噬細胞和共培養的4T1/巨噬細胞的體外細胞毒性。結果表明，在所有測試組中，IL -4處理的巨噬細胞的細胞存活率> 95%。經DS-Ce6或未經激光處理的Ce6共培養細胞毒性可忽略不計，這意味著未經激光處理的DS-Ce6不發揮細胞毒性作用。而后作者在共培養的4T1/巨噬細胞中檢測了IL-4處理的巨噬細胞對游離Ce6和DS-Ce6的細胞內攝取以及DS-Ce6與巨噬細胞的特異性結合。在IL-4處理的巨噬細胞中，DS-Ce6的細胞攝取高于游離Ce6；此外，在IL-4處理的巨噬細胞中，DS-Ce6的內化比正常巨噬細胞強得多。數據表明，IL-4誘導的M2巨噬細胞上調SR-A的表達，且DS-Ce6進入M2巨噬細胞是通過特異性結合SR-A介導的。

作者通過生物發光成像來評估DS-Ce6在激光照射下對共培養4T1-Luc/巨噬細胞的體外光療作用。數據表明，DS-Ce6處理后共培養細胞中4T1細胞的BLI明顯降低，且呈劑量和激光照射時間依賴性。此外，在DS-Ce6處理的4T1/巨噬細胞共培養中，即使激光照射時間較短，4T1細胞的BLIs也明顯低于Ce6處理組。而后作者評估了Caspase-3和下游PARP的水平，因為Caspase-3可被來自內在和外在途徑的刺激激活造成凋亡，Western blot分析進一步證實了DS-Ce6光激活后4T1-Luc/巨噬細胞凋亡且定量數據顯示，與Ce6處理的共培養細胞相比，激光照射下，DS-Ce6處理的共培養細胞中Caspase-3和PARP的表達水平增加。CLSM圖像證實，在共培養細胞中，DS-Ce6比Ce6能特異性靶向且更內化DS-Ce6進入M2樣巨噬細胞。將DS-Ce6內化到M2樣巨噬細胞中，在激光照射下產生細胞毒性1O2，產生的1O2有效誘導M2樣巨噬細胞和腫瘤細胞凋亡，導致共培養組4T1細胞BLI降低。這些結果表明，DS-Ce6也能有效誘導4T1/巨噬細胞共培養的腫瘤細胞凋亡。

PDT藥物通常對細胞單層表現出體外光療作用。然而，單層細胞培養模型在復制和模擬實體腫瘤的缺氧條件、病理生理和多細胞耐藥方面存在局限性。因此，作者使用4T1/巨噬細胞的3D球體進一步評估DS-Ce6的光療潛力。從結果可以看出，未經激光照射的Ce6或DS-Ce6處理后的三維球體保持了三維球體的形態。然而，在激光照射下，DS-Ce6治療組三維球體的形態學變化比Ce6組更顯著，證實了DS-Ce6對三維球體的光療效果要強得多。

作者采用全身熒光法檢測Ce6和DS-Ce6在體內的生物分布。結果表明在注射后最初1-2小時，Ce6處理小鼠全身可見較強的熒光強度，此后熒光強度迅速下降。注射后12小時，在游離Ce6處理小鼠中觀察到微弱的熒光信號，這意味著大部分Ce6從體內清除。相比之下，在注射后最初1-3小時，DS-Ce6處理小鼠的熒光信號相對較低，此后熒光信號逐漸減弱，但在24小時內全身仍可見。由于DS-Ce6與Ce6相比血液循環更長，因此在注射后12小時，DS-Ce6在腫瘤組織中的積累量相對高于游離Ce6。通過實驗結果作者證實了M2巨噬細胞在腫瘤組織內的分布，證明了DS-Ce6對M2巨噬細胞的靶向能力。

熒光結果顯示，DS-Ce6處理組的熒光信號強于游離Ce6處理組，表明DS-Ce6對M2巨噬細胞的靶向能力高于游離Ce6，這是由于DS-Ce6與M2樣TAM上過表達的SR-A特異性結合。同時，觀察到大量F4/80(綠色)和CD206(藍色)雙陽性巨噬細胞，F4/80和CD206在4T1腫瘤組織內共定位良好，表明M2巨噬細胞在腫瘤組織中浸潤分布豐富。更重要的是，F4/80和CD206陽性的M2巨噬細胞與DS-Ce6的熒光信號匹配良好，表明DS-Ce6可以特異性靶向腫瘤組織內的M2樣TAM。