IF 12.5 一區： 給“病毒刺客”裝上GPS：人工抗原如何照亮噬菌體

本研究開發了一種基于噬菌體的人工抗原導向免疫識別標記納米平臺（Mn2+@Man-噬菌體），該平臺通過在免疫抑制微環境中搭建細菌與巨噬細胞之間的“橋梁"，介導免疫級聯反應的發生。

共價結合將甘露糖連接子[N-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇-甘露糖（NHS-PEG-甘露糖）]修飾到噬菌體上（形成Man-噬菌體），并通過靜電相互作用將錳離子（Mn2?）礦化到噬菌體頭部。噬菌體憑借其固有生物學特性，對細菌具有*的靶向能力；而甘露糖功能化后，可通過多價結合與巨噬細胞表面的甘露糖受體作用，進一步促進免疫細胞對細菌的識別和吞噬。

為進一步驗證Mn2?@Man-噬菌體的表征，研究中采用TEM觀察，發現制備的Mn2?@Man-噬菌體與裸噬菌體具有相似的規則結構，但形態發生改變（圖B），且頭部直徑與尾長的比例與裸噬菌體存在顯著差異。

紫外-可見（UV-Vis）光譜顯示，Man-噬菌體和Mn2?@Man-噬菌體在260nm處的吸光度升高，這源于（MnCl?）在221nm處的吸收峰以及NHS-PEG-甘露糖在227nm和266nm處的吸收峰（圖C）。

動態光散射（DLS）測量顯示，裸噬菌體、Man-噬菌體和Mn2?@Man-噬菌體的水動力學直徑分別為162.70±2.29nm、215.27±2.31nm和235.2±1.22nm（圖D）。相應地，經原位甘露糖化修飾和溫和礦化后，Mn2?@Man-噬菌體的電位較裸噬菌體有所升高，但仍整體帶負電，且在水溶液中具有良好的分散性和穩定性（支撐材料：圖S4A、B）。

Mn2?@Man-噬菌體的元素 mappings顯示碳（C）、氧（O）和錳（Mn）呈特征性分布（圖F），與X射線能譜分析結果一致（支撐材料：圖S3C），證實Mn2?已成功礦化到Man-噬菌體頭部。通過原子力顯微鏡（AFM）進一步表征發現，裸噬菌體呈現典型的頭-尾病毒結構（圖G），而經甘露糖修飾和Mn2?礦化后，Mn2?@Man-噬菌體的整體輪廓（尤其是頭部）顯著增大（圖H-J）。

通過噬菌斑計數評估工程化噬菌體的活性，發現Man-噬菌體和Mn2?@Man-噬菌體的滴度與裸噬菌體相當（圖K、L），表明甘露糖化和礦化主要發生在噬菌體頭部，而噬菌體尾部的完整結構得以保留。

考慮到Mn2?在治療系統中關鍵的金屬免疫調控作用，我們通過電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）評估Mn2?@Man-噬菌體中Mn2?的釋放情況：在Transwell小室外側包裹一層10kDa透析膜以建立Mn2?釋放模型（支撐材料：圖S5A）；噬菌斑實驗證實，噬菌體無法透過透析膜而保留在上室，因此工程化噬菌體頭部釋放的Mn離子可進入下室（支撐材料：圖S5B）。

如圖M所示，Mn2?@Man-噬菌體的Mn離子釋放具有pH響應性——當釋放緩沖液pH從7.0降至5.0時，Mn2?的初始爆發釋放速率顯著加快。上述數據證實，我們成功合成了基于噬菌體的免疫識別標記納米平臺。

將Mn2?@Man-噬菌體與大腸桿菌混合孵育15分鐘后，再與RAW264.7巨噬細胞共培養。TEM圖像顯示，Mn2?@Man-噬菌體可錨定在大腸桿菌表面（圖B），表明細菌標記成功。此外，利用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的Mn2?@Man-噬菌體、1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DiR）染色的大腸桿菌，以及表達mCherry的RAW264.7巨噬細胞，我們通過可視化觀察發現，RAW264.7巨噬細胞可識別并吞噬被標記的大腸桿菌，表明Mn2?@Man-噬菌體能在免疫細胞與病原體之間搭建“橋梁"（圖C）

流式細胞術分析顯示，在Man-噬菌體介導下，RAW264.7巨噬細胞對大腸桿菌的吞噬活性高于裸噬菌體組（裸噬菌體組吞噬率為44.6%，Man-噬菌體組為56.3%），而Mn2?@Man-噬菌體介導的吞噬率最高（84.3%）（圖D、E），熒光染色和TEM圖像也證實，Mn2?@Man-噬菌體組的RAW264.7巨噬細胞吞噬作用較顯著（圖F）。

通過人工抗原評估RAW264.7巨噬細胞對被標記細菌的殺菌能力：瓊脂平板培養和活/死染色結果顯示，在無巨噬細胞參與時，Mn2?@Man-噬菌體的殺菌活性與裸噬菌體相當——與對照組相比，裸噬菌體組和Mn2?@Man-噬菌體組的細菌菌落數分別降至56.88±1.90%和57.45±4.67%（支撐材料：圖S6A-C）。

而與RAW264.7巨噬細胞共培養24小時后，Mn2?@Man-噬菌體介導的細菌存活率顯著降低（圖G）。與對照組相比，裸噬菌體組、Man-噬菌體組和Mn2?@Man-噬菌體組的胞外細菌存活率分別為43.04±5.99%、29.53±1.53%和15.04±6.71%，表明Man-噬菌體可在一定程度上介導巨噬細胞清除胞外細菌，而Mn2?@Man-噬菌體進一步增強了這一效果。

此外，裂解細胞后收集上清液評估胞內細菌存活率，發現Mn2?@Man-噬菌體組與對照組的差異較顯著，胞內細菌存活率僅為6.18±2.26%（圖G、H）。值得注意的是，即使是噬菌體耐藥菌，經納米平臺標記后，仍能被RAW264.7巨噬細胞有效吞噬和殺傷（支撐材料：圖S7）。

在各類細胞群體中，巨噬細胞的優勢亞群決定了機體抗感染免疫的方向。M1型活化巨噬細胞最初被認為在對抗入侵病原體中起關鍵作用；而細菌長期感染會觸發巨噬細胞從促炎狀態向免疫抑制狀態（M2型表型）轉變，從而促進感染持續發展。已有研究證實，錳（Mn2?）等營養金屬離子可激活環磷酸鳥苷-腺苷合成酶-干擾素基因刺激因子（cGAS-STING）通路，增強免疫效能。

利用Mn2?釋放模型，分析RAW264.7巨噬細胞的極化狀態：將M0型和M2型RAW264.7巨噬細胞分別在Mn2?釋放模型的下室培養24小時。

流式細胞術分析證實，Mn2?@Man-噬菌體釋放的Mn2?顯著提高了M0型RAW264.7巨噬細胞中M1/M2標志物（CD86/CD206、iNOS/Arg-1）的比值。

同時，Mn2?@Man-噬菌體組的M2型RAW264.7巨噬細胞被有效重編程為殺菌表型：CD86?和iNOS?巨噬細胞比例分別從31.7%和3.56%升至53.2%和24.7%，而CD206?和Arg-1?巨噬細胞比例分別從82.8%和21.2%降至43.2%和10.4%（圖D、E）。

深入探究Mn2?@Man-噬菌體誘導的基因組變化，采用RNA測序分析其轉錄組圖譜。

火山圖顯示，Mn2?@Man-噬菌體處理后共鑒定出2200多個差異表達基因（DEG），且這些基因主要參與促炎應答（圖A）。KEGG富集分析顯示，Mn2?@Man-噬菌體處理后，免疫相關激活通路中候選基因的富集因子變化較為顯著，包括IL-17、TNF、NF-κB和核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）樣信號通路（圖5B）。基因集富集分析（GSEA）結果與之一致，進一步證實RAW264.7巨噬細胞對病原體的激活效應（圖C）。

轉錄圖譜熱圖顯示，Mn2?@Man-噬菌體處理后，巨噬細胞中免疫激活相關基因表達上調，包括抗原呈遞共刺激分子（如CD40、CD80、CD86、Icosl）和促炎細胞因子（如IL-6、IL-1β、Nos2、TNF-α、IL-12）的轉錄水平廣泛升高（圖D）。此外，實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測也發現，促炎基因（Tnfa、Il1b、Nos2）的表達呈顯著上調趨勢（圖E）。

此外，基因本體論（GO）數據庫分析顯示，上調基因與巨噬細胞表型和金屬離子結合相關——生物學過程和分子功能的頂級富集術語包括巨噬細胞激活、促炎應答、Mn2?結合以及免疫應答相關細胞因子產生（圖F）。

為探究Mn2?@Man-噬菌體的感染靶向潛力，在單只小鼠上進行了對比建模實驗：右側脛骨植入無菌物體，左側脛骨植入被大腸桿菌污染的植入物（圖A）。大腸桿菌感染24小時后，向小鼠靜脈注射裸噬菌體和Mn2?@Man-噬菌體，并利用活體熒光成像系統（IVIS）檢測其分布。

如圖B、C所示，注射后2小時即可在感染脛骨處觀察到熒光信號，且信號強度隨時間逐漸增強，在注射后12小時達到峰值；而未感染部位的熒光信號無顯著變化。這些結果表明，Mn2?@Man-噬菌體可精準結合大腸桿菌，從而實現細菌清除和免疫調控。

此外，我們評估了Mn2?@Man-噬菌體的治療效果（圖D）。治療后第7天，接受Mn2?@Man-噬菌體治療的小鼠感染嚴重程度顯著減輕：蘇木精-伊紅（H&E）染色和吉姆薩染色顯示，骨髓中中性粒細胞浸潤和細菌載量顯著降低（圖E）；掃描電子顯微鏡（SEM）結果顯示，Mn2?@Man-噬菌體組植入物上的細菌菌落被顯著清除（圖E）。

同時，膝關節腫脹減輕、膝關節周長縮小、體重恢復以及組織學評分降低，均表明Mn2?@Man-噬菌體具有優異的抗菌效果（圖F-I）。

瓊脂平板培養結果與上述一致：Mn2?@Man-噬菌體處理后，骨髓和植入物中的細菌菌落數均大幅減少。與對照組相比，Mn2?@Man-噬菌體組骨髓和植入物中的細菌計數均降低6個數量級，而裸噬菌體組僅降低4個數量級（圖J）。

免疫熒光染色圖像顯示，Mn2?@Man-噬菌體可介導巨噬細胞向M1型極化，表現為CD86和iNOS表達升高（圖B、C）。

M1型極化巨噬細胞在宿主抗感染防御中起重要作用：它們遷移至感染部位后，識別并吞噬入侵細菌，隨后發揮細胞毒性作用，并向適應性免疫細胞呈遞抗原。同時，CD4?和CD8?T細胞的級聯激活需要M1型巨噬細胞提供充足的抗原呈遞。

Mn2?@Man-噬菌體治療后，免疫組化染色顯示骨髓中CD4?和CD8?T細胞浸潤增加，表明Mn2?@Man-噬菌體激活的巨噬細胞可通過吞噬細菌并向T細胞呈遞抗原，促進T細胞激活（圖D、E）。

本研究基于噬菌體捕食的固有機制，提出了一種創新的抗細菌感染噬菌體免疫療法——該療法通過在宿主免疫抑制微環境中重建細菌與巨噬細胞之間的“橋梁"，介導抗感染免疫級聯反應的發生。所有數據均證實，我們的納米平臺可有效激活免疫應答，實現細菌清除。此外，研究結果表明，經修飾的噬菌體可作為細菌表面的“人工抗原"，用于宿主細胞免疫監視；且該治療系統可擴展應用于多種免疫細胞和病原體。

鑒于傳統抗生素替代方案的迫切需求，本策略通過整合免疫治療特性，為噬菌體療法帶來創新，為其在臨床感染治療中的應用奠定基礎。

機制創新：揭示噬菌體單獨療法的局限：不能有效激活宿主免疫，導致耐藥菌和免疫抑制環境持續存在。提出通過“人工抗原標記"重建細菌與免疫系統的連接。

材料策略創新：將噬菌體殘留衣殼“二次利用"為人工免疫標記載體。引入 甘露糖+Mn2? 雙功能化：甘露糖增強巨噬細胞受體識別。Mn2?作為免疫金屬因子，觸發 cGAS-STING 信號，推動 M1 極化。

治療模式創新：不再僅依賴噬菌體直接裂解，而是通過“噬菌體-宿主免疫雙橋梁"實現細菌清除。同時激活 先天免疫（巨噬細胞）+ 適應性免疫（T細胞），構建系統性免疫反應。

該策略可適配多種噬菌體，不限于單一病原體，甚至可與噬菌體雞尾酒聯合。可接駁不同免疫配體，具備較高的可擴展性與轉化潛力。